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　　摘要：目的 探討藁本內(nèi)酯抗人肺癌A549細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。方法 CCK-8法檢測(cè)藁本內(nèi)酯對(duì)A549細(xì)胞活力的影響，TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，Hoechst 33258熒光染色法觀察A549細(xì)胞的形態(tài)變化，ELISA檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)含量，Western blot檢測(cè)核因子-κB(NF-κB)、Bcl-2、Bax及磷酸化JNK蛋白表達(dá)。結(jié)果 15、30、60、120、180 μmol/L藁本內(nèi)酯作用12、24、48 h能抑制A549細(xì)胞活力(P<0.05，P<0.01， P<0.001)，并呈劑量及時(shí)間依賴(lài)(P<0.05，P<0.01);30、60、120 μmol/L藁本內(nèi)酯作用12、24、48 h，細(xì)胞凋亡率呈時(shí)間和劑量依賴(lài)(P<0.05，P<0.01);經(jīng)藁本內(nèi)酯處理48 h后，A549細(xì)胞核可見(jiàn)明顯凋亡形態(tài)，包括核皺縮、碎裂、亮藍(lán)色熒光，染色質(zhì)分割產(chǎn)生凋亡小體;30、60、120 μmol/L藁本內(nèi)酯細(xì)胞核內(nèi)NF-κB蛋白p65亞基表達(dá)升高、細(xì)胞內(nèi)JNK蛋白磷酸化水平升高、抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低及促凋亡蛋白Bax表達(dá)升高(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。結(jié)論 藁本內(nèi)酯通過(guò)抑制VEGF的表達(dá)而抑制腫瘤新生血管的形成，通過(guò)調(diào)控NF-κB蛋白表達(dá)及JNK蛋白磷酸化水平，降低Bcl-2/Bax比值，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

　　關(guān)鍵詞：藁本內(nèi)酯;A549細(xì)胞;凋亡;血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子;核因子-κB

　　藁本內(nèi)酯是當(dāng)歸、川芎等中藥中主要活性成分之一，對(duì)心腦血管、循環(huán)系統(tǒng)及免疫功能均有較強(qiáng)的藥理作用[1-2]。研究表明，藁本內(nèi)酯具有抗腫瘤活性，能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移及腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)[3-5]。本研究以肺腺癌A549細(xì)胞為模型，觀察藁本內(nèi)酯誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的影響，并探討其作用機(jī)制，以期為臨床藁本內(nèi)酯治療肺癌提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

　　1 材料與方法

　　1.1 藥物與細(xì)胞

　　藁本內(nèi)酯，天津士蘭科技有限公司，純度>98%;A549細(xì)胞購(gòu)自ATCC。

　　1.2 主要試劑與儀器

　　CCK-8試劑盒，上海博谷生物科技有限公司;蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、TUNEL試劑盒及人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)ELISA試劑盒，Roche公司;Hoechst 33258試劑盒，上海依科賽生物制品有限公司;細(xì)胞核和胞質(zhì)蛋白提取試劑盒，生工生物工程上海(股份)有限公司;DMSO及胎牛血清(FBS)，Gibco公司;兔抗人核因子-κB(NF-κB)、磷酸化-JNK(P-JNK)、Bcl-2及Bax抗體，Santa Cruz公司。熒光顯微鏡IX51(日本Olympus公司)，ELx800酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)，Z-323高速低溫離心機(jī)(德國(guó)HERMLE公司)，F(xiàn)CM流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD)。

　　1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

　　A549細(xì)胞在含10%胎牛血清和青霉素100 μg/L、鏈霉素100 μg/L的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2孵育。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，2～3 d傳代1次。細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%時(shí)，serum- starved 10 h后用于實(shí)驗(yàn)。

　　1.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力

　　取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，37 ℃預(yù)熱，PBS洗3次， 0.25%胰酶消化，制成細(xì)胞懸液，以100 μL/孔(6000 cells)接種在在96孔板中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%時(shí)，serum-starved 10 h。給予含藁本內(nèi)酯15、30、60、120、180 μmol/L的無(wú)血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48 h，溶劑對(duì)照給予稀釋倍數(shù)與最大藥物濃度相同的DMSO(下同)。除去含藥/溶劑培養(yǎng)基，并用新鮮培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2次，加入新的培養(yǎng)基，每孔加入10 μL CCK-8溶液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h后用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度(OD值)。

　　1.5 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

　　取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以2 mL/孔(3×105 cells)接種在6孔板中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%時(shí)，serum-starved 10 h。實(shí)驗(yàn)組給予藁本內(nèi)酯30、60、120 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48 h。1500 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，置水平搖床上緩慢搖動(dòng)30～60 min，重懸細(xì)胞，然后根據(jù)TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

　　1.6 Hoechst 33258熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞核形態(tài)

　　細(xì)胞接種同“1.3”項(xiàng)。6孔板中置大小合適滅菌的載玻片。serum-starved 10 h后，實(shí)驗(yàn)組分別給予30、60、120 μmol/L藁本內(nèi)酯，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。棄去培養(yǎng)液，用4%多聚甲醛在4 ℃條件下固定15 min，棄固定液養(yǎng)液，Hoechst 33258染色液室溫條件下染色15 min。鏡檢。

　　1.7 ELISA檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子含量

　　細(xì)胞接種同“1.3”項(xiàng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以2 mL/孔(3×105 cells)接種在6孔板中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%時(shí)，serum- starved 10 h。實(shí)驗(yàn)組給予含藁本內(nèi)酯30、60、120 μmol/L的無(wú)血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。取培養(yǎng)液，1000 r/min離心5 min，除去細(xì)胞碎片及顆粒物，收集上清。根據(jù)VEGF試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

　　1.8 Western blot檢測(cè)核因子-κB、磷酸化JNK、Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)

　　按“1.3”項(xiàng)步驟收集細(xì)胞培養(yǎng)液，冰浴的PBS洗1遍，用細(xì)胞刮子刮下細(xì)胞，1000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞沉淀，分別提取總蛋白和細(xì)胞核蛋白。在細(xì)胞沉淀中加入適量裂解液(含蛋白酶或磷酸酶抑制劑)，冰浴裂解30 min，每隔10 min高速渦旋15 s。4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清，BCA法測(cè)定樣品中總蛋白濃度;用細(xì)胞核蛋白抽提試劑盒，根據(jù)說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞核蛋白。上樣量為40 μg。一抗(兔抗人NF-κB(p65)、P-JNK、Bcl-2、Bax均按1∶1000稀釋)4 ℃過(guò)夜，二抗(1∶10 000稀釋)37 ℃孵育2 h， ECL法顯色。采用軟件Image pro plus 6.0分析條帶的積分光密度。

　　1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

　　采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以─x±s表示，結(jié)果中“2.1”“2.2”項(xiàng)采用雙因素分析，其余數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素分析及LSD-t組間檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

　　2 結(jié)果

　　2.1 藁本內(nèi)酯對(duì)A549細(xì)胞活力的影響

　　與溶劑對(duì)照組比較，予藁本內(nèi)酯孵育12、24、48 h后，細(xì)胞活力均明顯下降(P<0.05，P<0.01，P<0.001)，說(shuō)明藁本內(nèi)酯能夠抑制A549細(xì)胞的增殖，其IC50分別為121.98、89.99、62.70 μmol/L。藁本內(nèi)酯對(duì)A549細(xì)胞的抑制作用呈時(shí)間和濃度依賴(lài)性(P<0.05，P<0.01)，兩者之間無(wú)交互作用(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1。

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